REPLI-g單細胞試劑盒

從單個細胞或有限的樣品材料中進行高度均勻的全基因組擴增（WGA）

• 單細胞材料的WGA具有完整的基因組覆蓋范圍
• 由于MDA技術，基因組基因座的無偏擴增
• 經過優化，可與包括NGS在內的新技術配合使用
• 一致的產量高達40 µg（平均產物長度> 10 kb）
• 用于癌癥研究，干細胞研究或宏基因組學的新型工具

使用創新儀器（例如下一代測序（NGS）平臺）進行生物樣品的DNA序列分析和基因分型通常受限于少量樣品。REPLI-g單細胞試劑盒專門設計用于從單細胞（1至<1000個細菌或腫瘤細胞）或純化的基因組DNA中均勻擴增基因組DNA，并具有完整的基因組覆蓋范圍。其他協議也可用于新鮮或干燥血液或新鮮或冷凍組織。的緩沖液和試劑經過*的受控去污程序，以避免擴增污染性DNA，從而確保每次都獲得高度可靠的結果。創新的多重置換擴增（MDA）技術可實現具有可忽略的序列偏倚且無基因組缺失的基因組準確擴增。

REPLI-g單細胞試劑盒

REPLI-g單細胞試劑盒適用于分子生物學應用。本產品不用于診斷，預防或治療疾病。

產品詳情

性能

完整的基因組覆蓋范圍，非常適合NGS和其他下游應用

使用REPLI-g單細胞試劑盒擴增的DNA的平均產物長度> 10 kb，并具有大的基因組覆蓋范圍。它已通過眾多下游分析進行了測試，并非常適用于這些分析，包括下一代測序（NGS），陣列比較基因組雜交（aCGH）和基于實時PCR的應用（請參見表2）。由于不需要單獨的基于PCR的擴增步驟，因此與基于PCR的方法相比，REPLI-g全基因組擴增和文庫制備所需的動手時間更少，讀取長度更長（請參見“使用與基于PCR的方法相比，REPLI-g擴增的DNA需要更少的動手時間并產生更多的序列信息“）。高質量的，可比的NGS結果表明，純化的基因組DNA或REPLI-g單細胞擴增的DNA均可實現高百分比的序列覆蓋率和非常低的錯誤率，包括僅從單個細菌細胞開始的情況（見圖） “可比NGS結果”）。這些發現是通過寬范圍的標記覆蓋所有人類常染色體和X染色體的全面分析強調，具有3個不同的獨立的實驗表明DNA被成功地從基因組的所有區域擴增無單次輟學（見圖“完整的基因組覆蓋范圍”）。

REPLI-g單細胞試劑盒優于其他供應商的試劑盒

其他供應商通常使用的基于PCR的WGA方法導致短片段被PCR引物序列終止，這可能會影響下游過程（例如，下一代測序；請參見圖“使用REPLI-g擴增的DNA進行的下一代測序需要更少的動手時間，比基于PCR的方法產生更多的序列信息”）。基于PCR的WGA可能導致容易出錯的擴增，例如，導致單個堿基對突變，STR收縮和擴增，并且由于使用低保真酶Taq而導致基因座的偏倚和代表性不足DNA聚合酶。相比之下，REPLI-g單細胞試劑盒可在整個基因組中提供高度均勻的擴增，且擴增過程中基因座偏向小。使用每種試劑盒*的單細胞擴增方案，測試了四種WGA試劑盒（包括REPLI-g單細胞試劑盒）和2種利用MDA技術的2種基于PCR的方法的序列表示和基因座缺失。與REPLI-g單細胞試劑盒不同，使用其他供應商的試劑盒分析的單細胞通常無法完整無偏地顯示序列（請參見“從單細胞無偏DNA擴增”圖）。

原理

REPLI-g單細胞試劑盒包括REPLI-g sc聚合酶，這是創新的高保真酶Phi 29聚合酶的優化配方，可使用多重置換擴增（MDA）技術擴增復雜的基因組DNA，并進行溫和的堿性孵育以確保非常低的DNA/片段化或無堿基位點的產生。它經過專門設計，可從單個細胞（例如分離的腫瘤細胞或細菌）提供高產量的擴增DNA（請參見表1）。此外，它還可以用于各種臨床和非臨床研究樣品以及純化的基因組DNA，同時還可以使用其他方案來處理新鮮或干燥的血液以及新鮮或冷凍的組織。無論模板的起始量如何，典型的DNA產量始終可達到40 µg，這意味著隨后的遺傳分析無需進一步測量DNA濃度即可進行。平均產物長度超過10 kb，并且具有完整的基因組覆蓋范圍，確保使用REPLI-g單細胞試劑盒擴增的DNA非常適合眾多下游應用，包括下一代測序（NGS），基于陣列的比較基因組雜交（陣列CGH） ），焦磷酸測序和實時PCR分析（表2）。

放大原理

REPLI-g單細胞試劑盒使用等溫基因組擴增，稱為多重置換擴增（MDA），涉及隨機六聚體與變性DNA的結合，然后在恒定溫度下用優化形式的Phi 29聚合酶進行鏈置換合成，它具有異常強的股線位移特性。在每條置換的鏈上都可充當模板，從而引發額外的引發事件，從而可產生高產量的擴增DNA（見圖“多重置換擴增（MDA）技術”）。Phi 29聚合酶是一種噬菌體衍生的酶，是一種具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校對活性）的DNA聚合酶，其保真度比Taq高1000倍DNA聚合酶。在*，優化的REPLI-g單細胞緩沖液系統的支持下，Phi 29聚合酶可以輕松解決二級結構（如發夾環），從而防止擴增過程中聚合酶的滑動，終止和解離。這樣就可以產生高達100 kb的DNA/片段，而不會產生序列偏倚（請參見“用Phi 29聚合酶進行無偏擴增”）。

DNA的細胞裂解和堿變性

在用于酶促擴增程序之前，必須先對基因組DNA進行變性，這通常使用苛刻的方法完成，例如在高溫下孵育（熱孵育）或在pH值升高（化學堿性孵育）的情況下。REPLI-g單細胞試劑盒使用溫和的堿性孵育，可實現gDNA的細胞裂解和均勻的DNA變性，而DNA/片段化程度極低或無堿基位點的產生。這導致擴增的DNA具有非常高的完整性，并大化了擴增片段的長度，因此基因組位點和序列被均勻地表示（參見“熱和堿變性對位點表示的影響”圖）。

有效消除可檢測的DNA污染

所有REPLI-g單細胞試劑盒組件均經過*的受控去污程序，以確保消除所有REPLI-g可擴增的污染DNA。通過創新和標準化的程序將緩沖液和試劑暴露在紫外線輻射下，以確保不存在任何可檢測到的殘留污染性DNA（請參見“創新性去污程序”圖）。經過紫外線處理后，套件會進行嚴格的質量控制，以確保完整的功能。

程序

簡單的一管程序

REPLI-g單細胞試劑盒使用簡單可靠的方法從單細胞或有限樣品中獲得準確的基因組擴增。簡單的反應設置和非常短的處理時間（約15分鐘）使這成為一種簡單而可靠的方法（請參見“ REPLI-g單細胞試劑盒程序”圖）。已開發出的緩沖液和試劑，可從單個細胞，有限的組織材料和純化的DNA中獲得高產量的DNA，并具有完整的序列表示和無偏擴增（表3）。REPLI-g擴增的DNA可以在–20°C下長期保存，不會產生負面影響（請參見“一致的長期穩定性”圖）。